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Public Health England Confirma Que O Teste De PCR Não Consegue detetar Vírus Infeciosos

Compreendendo o limite do ciclo (Ct) em SARS-CoV-2 RT-PCR

Um guia para equipes de proteção à saúde

Conteúdo

  • Mensagens importantes…………………………………….……… 3
  • O Que É O RT-PCR?……………………………………..………………4
  • Como É Realizado O RT-PCR ?…….………………………..…….. 4
  • Ensaios RT-PCR ……………………………………….…………………5
  • Resumo ………………………………………………………………….. 10
  • Referências ………………………………………..………………….. 11

Mensagens Importantes

O limiar do ciclo (Ct) é um valor semi-quantitativo que pode categorizar amplamente a concentração de material genético viral numa amostra de paciente após testes por RT-PCR como baixo, médio ou alto – ou seja, diz-nos aproximadamente quanto material genético viral está na amostra.

Um Ct baixo indica uma alta concentração de material genético viral, que normalmente é associado a alto risco de infecciosidade.

Um Ct alto indica uma baixa concentração de material genético viral que é tipicamente associado a um menor risco de infecciosidade. No contexto de uma amostra do trato respiratório superior, um Ct alto também pode representar cenários em que persiste um maior risco de infeção – por exemplo, infeção precoce, coleta inadequada ou amostra degradada.

Um único valor de Ct na ausência de contexto clínico não pode ser invocado para a decisão sobre a infetividade de uma pessoa.

Os valores de Ct não podem ser comparados diretamente entre ensaios de diferentes tipos – nem todos laboratórios usam o mesmo ensaio e, alguns podem usar mais de um.

O Que É O RT-PCR?

A reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) é uma técnica laboratorial estabelecida que pode ser usada para identificar a presença de material genético específico por meio de um processo bioquímico de amplificação usando enzimas e é baseado no reconhecimento de alvos específicos.

O material genético inclui DNA e RNA, mas no contexto de RT-PCR é o RNA que é detetado. O SARS-CoV-2 tem um genoma de RNA. Os principais benefícios do RT-PCR são capazes de detetar quantidades extremamente pequenas de RNA de patógenos num curto período Tempo.

O RT-PCR revolucionou, portanto, a velocidade e a sensibilidade de diagnósticos e pode ser adaptado para testar em grande rendimento usando automação com necessidade reduzida de conhecimento técnico. As aplicações modernas do RT-PCR permitem que a reação seja monitorada durante cada etapa, conhecida como RT-PCR em tempo real.

Como É Realizado O RT-PCR?

Muitas vezes anunciado como um dos avanços científicos mais importantes em biologia molecular, o PCR revolucionou o estudo do DNA a tal ponto que o seu criador, Kary B. Mullis, recebeu o Prémio Nobel de Química em 1993. A primeira etapa do SARS-CoV -2 RT-PCR é extrair o RNA viral da amostra para purificar, estabilizar e concentrá-lo, para aumentar a deteção de amostras contendo baixa quantidade de vírus. O extrato purificado é adicionado a uma mistura de reação bioquímica que inclui:

  • primers – trechos curtos de ácido nucleico que correspondem a partes do organismo genoma alvo.
  • bases de nucleotídeos (os blocos de construção dos ácidos nucleicos).
  • enzimas para iniciar e completar a reação.
  • sondas fluorescentes rotuladas – pequenos trechos de ácido nucleico que reconhecem e agarram-se no produto de reação (o indicador de reação)

Os primers ligam-se a regiões-alvo do ácido nucleico viral, permitindo que a enzima adicione nucleotídeos para alongar uma fita de DNA complementar (cDNA). A amostra de reação a mistura é submetida a ciclos térmicos repetidos para que as cópias do alvo viral sejam multiplicadas por ciclo levando a um aumento exponencial. As sondas marcadas emitem um sinal fluorescente na presença de um alvo recentemente sintetizado. Quanto mais cedo esse aumento exponencial ocorre, maior é a quantidade de vírus na amostra.

A Figura 1 demonstra os estágios para a análise pós-execução do RT-PCR.

Ensaios RT-PCR

Existem muitos ensaios / plataformas SARS-CoV-2 RT-PCR diferentes em uso no Reino Unido. Cada ensaio terá um limite de deteção ligeiramente diferente (LoD) – a mais baixa concentração de vírus que pode ser detetada de forma confiável e consistente pelo ensaio e, será configurada de acordo com as disposições locais.

Alguns RT-PCRs são projetados para identificar um único gene alvo e outros irão detetar alvos múltiplos. Aqueles que detetam alvos múltiplos podem dar maior certeza ao interpretar os resultados. As discrepâncias em resultados entre alvos genéticos podem levar a incertezas na interpretação, particularmente onde um ensaio comercial está em uso e os dados brutos não estão acessíveis. Os ensaios altamente complexos com vários alvos podem estar sujeitos a deteção não específica que pode ser relatada incorretamente como positivo.

Figura 2. Genoma de SARS-CoV-2 com os alvos mais comuns de RT-PCR em destaque

O RT-PCR deteta a presença de material genético viral numa amostra, mas não é capaz de distinguir se o vírus infecioso está presente. A quantidade de vírus intacto na parte superior da amostra respiratória será afetada por fatores que são endógenos e exógenos a métodos de laboratório.

Fatores Exógenos Laboratoriais

1. A adequação da coleta da amosta.

2. A quantidade de vírus no local da coleta.

3. A presença de inibidores.

Fatores Endógenos Laboratoriais

1. O volume total do buffer/médio da coleta da amostra.

2. O método de preparação da amostra (métodos de calor, lise).

3. Os volumes dos reagentes laboratoriais utilizados em cada etapa do processo RT-PCR.

4. O ensaio RT-PCR de escolha.

O Que É Um Valor Ct?

O limite do ciclo (Ct) pode ser definido como o número do ciclo térmico no qual o sinal fluorescente excede o do fundo e, portanto, ultrapassa o limite para positividade (Figura 1, página 5).

Um ensaio RT-PCR típico terá um máximo de 40 ciclos térmicos. Quanto menor o valor Ct, maior será a quantidade de material genético viral na amostra (como um valor aproximado proxy para carga viral). Os valores de Ct obtidos desta forma são semiquantitativos e são capazes de distinguir entre a carga viral alta e baixa. Um aumento de 3 pontos no valor Ct é aproximadamente equivalente a uma diminuição de 10 vezes na quantidade de material genético viral.

Em algumas circunstâncias, os valores de Ct podem ser usados ​​como uma técnica mais quantitativa para medir com precisão o número de cópias virais por célula na amostra original – no entanto, isso requer que a amostra seja testada juntamente com diluições padrão verificadas e que haja entrada de amostra fixa juntamente com a quantificação do conteúdo celular de uma amostra de zaragatoa (1,2). A maioria dos laboratórios de diagnóstico não realiza rotineiramente esta quantificação para amostras respiratória virais – o PCR quantitativo é mais comum na medição da carga viral transmitida pelo sangue.

Os valores de Ct não podem ser comparados diretamente entre ensaios de diferentes tipos devido a variação na sensibilidade (limite de deteção), química dos reagentes, alvos genéticos, ciclo parâmetros, métodos analíticos interpretativos, preparação e extração de amostras técnicas. Além disso, os valores Ct não são fornecidos para todos os métodos moleculares de deteção do SARS-CoV-2. Algumas técnicas comerciais de RT-PCR são fechadas como sistemas de ‘caixa preta’ em que o operador não pode observar a reação em tempo real e o resultado é interpretado pelo software num resultado positivo ou negativo não interrogável qualitativo.

Fonte:

https://davidicke.com/wp-content/uploads/2020/11/Understanding_Cycle_Threshold__Ct__in_SARS-CoV-2_RT-PCR_-1.pdf

Leitura Psíquica Com Graciano Constantino

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